Adaptación de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c para probar la eficacia de la vacuna

Modelado del SARS-CoV-2 en ratones

Entre las herramientas de investigación necesarias para desarrollar intervenciones médicas para tratar las infecciones por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo, en la parte superior de la lista se encuentran los modelos animales informativos con los que estudiar la patogénesis viral. Gu et al. desarrolló un modelo de ratón en el que una cepa de SARS-CoV-2 era infecciosa y podía provocar una respuesta inflamatoria y una neumonía moderada. La adaptación de esta cepa viral en el ratón parecía depender de un cambio crítico de aminoácidos, Asn501 a Tyr (N501Y), dentro del dominio de unión al receptor de la proteína pico viral. El nuevo modelo de ratón se utilizó para estudiar anticuerpos neutralizantes y una vacuna candidata contra el virus.

Ciencias, este número p. 1603

Abstracto

La pandemia actual de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha priorizado el desarrollo de modelos de animales pequeños para el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Adaptamos un aislado clínico de SARS-CoV-2 mediante pases seriados en el tracto respiratorio de ratones BALB / c envejecidos. La cepa adaptada al ratón resultante en el pase 6 (denominada MASCp6) mostró un aumento de la infectividad en el pulmón del ratón y provocó neumonía intersticial y respuestas inflamatorias en ratones jóvenes y ancianos después de la inoculación intranasal. La secuenciación profunda reveló un panel de mutaciones adaptativas potencialmente asociadas con el aumento de la virulencia. En particular, la mutación N501Y se localiza en el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico. La eficacia protectora de un candidato a vacuna RBD recombinante se validó utilizando este modelo. Por lo tanto, esta cepa adaptada al ratón y el modelo de exposición asociado deberían ser valiosos para evaluar vacunas y antivirales contra el SARS-CoV-2.

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo recién surgido se ha convertido en una crisis de salud global (13). En ausencia de inmunidad protectora en toda la población humana (4), El SARS-CoV-2 ha mostrado una capacidad de transmisión de persona a persona sin precedentes. Aunque actualmente se están probando varias vacunas candidatas en ensayos clínicos, actualmente no se encuentra disponible ninguna vacuna COVID-19 comercial.

El SARS-CoV-2 pertenece a la Betacoronavirus género del Coronaviridae familia, junto con otros dos virus altamente patógenos estrechamente relacionados, el SARS-CoV y el síndrome respiratorio coronavirus de Oriente Medio (MERS-CoV). El SARS-CoV-2 tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de 30 kb de longitud, que está recubierto por las proteínas de la nucleocápside interna (N) y una envoltura externa formada por proteínas de membrana (M) y envoltura (E). , así como proteínas de pico (S). Al igual que el SARS-CoV, la proteína S del SARS-CoV-2 media la entrada viral en las células huésped al unirse a su receptor compartido, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), a través del dominio de unión al receptor (RBD) (1). Anteriormente, nosotros y otros hemos demostrado que el RBD de SARS-CoV y MERS-CoV contienen importantes epítopos neutralizantes dependientes de la conformación y son capaces de provocar potentes anticuerpos neutralizantes en animales inmunizados, lo que representa objetivos prometedores para el desarrollo de vacunas (58).

Se necesitan con urgencia modelos de animales pequeños que recapitulan la infección por SARS-CoV-2. Debido a que el SARS-CoV-2 no usa ACE2 de ratón como receptor (1), se cree que los ratones de tipo salvaje son menos susceptibles al SARS-CoV-2. Se han desarrollado ratones transgénicos que expresan ACE2 humana mediante diferentes estrategias. Estos ratones se han utilizado anteriormente para estudiar la infección y patogénesis del SARS-CoV-2 y para evaluar las contramedidas contra COVID-19 (911). Aquí, informamos la generación de una cepa adaptada al ratón de SARS-CoV-2 que puede replicarse productivamente en el tracto respiratorio y causar neumonía intersticial en ratones inmunocompetentes de tipo salvaje. Además, se evaluó la eficacia protectora de una subunidad candidata a vacuna recombinante desarrollada recientemente basada en SARS-CoV-2 RBD utilizando este modelo de desafío de ratón.

Resultados

Adaptación rápida de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c

Para generar una cepa adaptada al ratón del SARS-CoV-2, el aislado clínico humano del SARS-CoV-2 (BetaCov / human / CHN / Beijing_IME-BJ05 / 2020, abreviado como IME-BJ05) se pasó en serie mediante inoculación intranasal en ratones de edad avanzada (Fig. 1A), como se describió anteriormente para el SARS-CoV (12). Brevemente, ratones BALB / c de 9 meses fueron inoculados intranasalmente con 7.2 × 105 unidades formadoras de placa (PFU) de SARS-CoV-2, y los tejidos pulmonares se recogieron de cada pase para el análisis de la carga de ARN viral 3 días después de la inoculación. ARN virales sustanciales (108.32 copias / g) se detectaron fácilmente después de un único pase, que se definió como pase 0 (P0), en el homogeneizado de pulmón (Fig. 1B). Posteriormente, las copias de ARN viral en el pulmón se acercaron a 1010,68 Copias de ARN / g en el pase 3 (P3), que fue aproximadamente 250 veces mayor que las de P0 y permaneció en un nivel similar durante los siguientes pases (Fig. 1B). La reserva viral final en el pase 6 (P6) se tituló mediante ensayos de placa (fig. S1A) y se denominó MASCp6 para una caracterización adicional.

Adaptación de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c para probar la eficacia de la vacuna

Figura 1 Generación y caracterización de una cepa adaptada al ratón de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c.

(UNA) Diagrama esquemático de la historia del paso de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c. Los virus originales del SARS-CoV-2 se muestran en negro y los virus adaptados en rojo. (si) Cargas de ARN genómico de SARS-CoV-2 en homogeneizados de pulmón de ratón en P0 a P6. Las copias de ARN viral se determinaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR). Los datos se presentan como medias ± SEM (norte = 2 a 4 ratones por grupo). (C) Distribución tisular de los ARN virales del SARS-CoV-2 en ratones infectados con MASCp6. Se inocularon grupos de ratones jóvenes y viejos con 1,6 × 104 PFU de MASCp6 y sacrificadas a los 3, 5 o 7 días después de la inoculación, respectivamente. Se recogieron heces, sueros y las muestras de tejido indicadas en los tiempos especificados y se sometieron a análisis de carga de ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa. Las líneas discontinuas indican el límite de detección. Los datos se presentan como medias ± SEM (norte = 3 ratones por grupo). (re) Tinción por inmunofluorescencia múltiple de secciones de pulmón de ratón. Proteína SARS-CoV-2 S (verde), CC10 (rojo), β-IV-tubulina (cian), PDPN (magenta), SPC (dorado) y núcleos (azul). El cuadro de guiones se amplía en la esquina inferior derecha de la misma imagen. Las puntas de flecha amarillas indican SARS-CoV-2+/ CC10+ celdas, las cabezas redarrow indican SARS-CoV-2+/ CC10+/ SPC+ celdas, y las puntas de flecha blancas indican SARS-CoV-2+/ SPC+ células.

Para determinar si el aumento de las cargas de ARN viral en los pulmones de los ratones podría atribuirse a la mayor infectividad del virus en los ratones, examinamos la cinética de replicación y el tropismo tisular de MASCp6 en BALB de edad (9 meses) y joven (6 semanas). / c ratones. Después de la inoculación intranasal con 1,6 × 104 PFU de MASCp6, se detectaron altas cantidades de ARN vírico en los pulmones y tráqueas a los 3, 5 y 7 días después de la inoculación en todos los ratones de edad avanzada (Fig.1C), con cargas máximas de ARN viral de ~ 1010 copias / ga 3 días después de la inoculación, lo que fue comparable con los resultados de los ratones transgénicos ACE2 humanos (10). También se detectaron ARN virales en corazón, hígado, bazo y cerebro, así como en heces. Se detectó ARN viral marginal en el riñón y suero de ratones infectados individuales (Fig. 1C). También se observó una distribución tisular similar del ARN del SARS-CoV-2 en los ratones jóvenes infectados con MASCp6 (Fig. 1C). La inmunotinción de la sección de pulmón de ratones infectados con MASCp6 mostró una expresión robusta de la proteína S a lo largo de las vías respiratorias y en el alvéolo en ratones tanto jóvenes como ancianos a los 3 y 5 días después de la inoculación (figura S1B). Para identificar los principales tipos de células infectadas por SARS-CoV-2 en nuestro modelo, las secciones de pulmón se analizaron adicionalmente mediante tinción de inmunofluorescencia múltiple para la proteína S del SARS-CoV-2 y marcadores específicos de células del epitelio pulmonar. Como se muestra en la Fig. 1D, la colocalización de CC10+ Se observaron células club y proteína SARS-CoV-2 S predominantemente en los bronquios y bronquiolos, así como en la unión bronquioalveolar-conducto (BADJ) de los pulmones. Además, SPC+ Las células alveolares de tipo 2 (AT2) también se combinaron con proteína S en el BADJ y los alvéolos. Sin embargo, la proteína SARS-CoV-2 S no se detectó en todas las β-IV-tubulina+ células ciliadas y PDPN+ células alveolares tipo 1 (AT1). Por lo tanto, las células club y las células AT2 son las principales células diana que apoyan la replicación del SARS-CoV-2 en el pulmón de ratón en nuestro modelo.

Caracterización de la infección por MASCp6 en ratones BALB / c

Para caracterizar aún más las características patológicas en los ratones BALB / c infectados con MASCp6, se recolectaron tejidos pulmonares a los 3 o 5 días después de la inoculación, respectivamente, y se sometieron a análisis histopatológico mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Tanto los ratones BALB / c de edad como los jóvenes presentaron neumonía de leve a moderada después de la infección con MASCp6 (Fig. 2, A y C). En los ratones envejecidos, la infección por MASCp6 causó neumonía intersticial a los 3 días después de la inoculación, caracterizada por células epiteliales desnaturalizadas y colapsadas, tabiques alveolares engrosados, daño alveolar, exudación focal y hemorragia e infiltración celular inflamatoria activada. Obviamente, los vasos estaban lesionados, con células inflamatorias adherentes y membrana basal dañada (Fig. 2A). A los 5 días después de la inoculación, el daño pulmonar fue mucho más leve que el observado a los 3 días después de la inoculación (Fig. 2A), lo que sugiere un proceso de autorrecuperación. Además, la tinción por inmunofluorescencia múltiple demostró que la infección por SARS-CoV-2 conducía a una muerte celular masiva, como lo demuestra la tinción con caspasa-3 escindida, a los 3 días de la inoculación, así como una notable infiltración de células inflamatorias en CD103.+ células dendríticas, CD163+ macrófagos y CD3+ Linfocitos T en el pulmón de ratones envejecidos (fig. S2A). Las concentraciones séricas de citocinas inflamatorias, incluidas interleucina-1β (IL-1β), IL-6 e IL-5, se regularon positivamente tras la exposición a MASCp6 (Fig. 2B y Fig. S3A). Como se esperaba, los ratones jóvenes desarrollaron un daño pulmonar similar pero mucho más leve que el de los ratones envejecidos después de la exposición a MASCp6 (Fig. 2C). De manera similar, la infiltración de células inflamatorias (figura S2B) y la respuesta de citocinas séricas (figura 2D y figura S3B) en los ratones jóvenes fue mucho más débil que la de los ratones envejecidos. Además, la infección por MASCp6 no provocó cambios evidentes en el peso corporal de los ratones jóvenes o de edad avanzada (fig. S4). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que MASCp6 puede replicarse productivamente en el tracto respiratorio inferior de los ratones BALB / c de tipo salvaje, dando como resultado un fenotipo de neumonía intersticial más grave en los ratones envejecidos.

Adaptación de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c para probar la eficacia de la vacuna

Figura 2 La infección por MASCp6 causa lesiones pulmonares patológicas y respuestas inflamatorias en ratones BALB / c jóvenes y viejos.

(UNA) Tinción H&E de secciones de pulmón de ratones BALB / c envejecidos (9 meses) infectados con MASCp6. Las flechas azules indican las áreas normales y las flechas amarillas indican las áreas dañadas. Los datos del análisis semicuantitativo de los cambios histopatológicos de los tejidos pulmonares se presentan como medias ± SEM (norte = 3 ratones por grupo). La significación estadística se analizó mediante la prueba de Mann-Whitney. (si) Mapa de calor de citocinas y quimiocinas en suero en ratones envejecidos infectados con MASCp6. Los datos se presentan como cambio de veces en relación con la infección simulada (norte = 5 ratones por grupo). (C) Tinción H&E de secciones de pulmón de ratones jóvenes infectados con MASCp6 (norte = 3 ratones por grupo). (re) Mapa de calor de citocinas y quimiocinas en suero en ratones jóvenes infectados con MASCp6 (norte = 5 ratones por grupo). *PAGS <0,05, ***PAGS <0,001.

Identificación de mutaciones adaptativas que surgieron en MASCp6

Para descifrar el mecanismo subyacente del aumento de la virulencia de MASCp6, se sometió el genoma completo de MASCp6 a una secuenciación profunda con un secuenciador Ion Torrent S5Plus. En comparación con el genoma completo de la cepa IME-BJ05 del SARS-CoV-2 original, MASCp6 contiene cinco mutaciones de nucleótidos que se distribuyen dentro de los genes ORF1ab, S y N, respectivamente (Fig. 3A y tabla S1). La mutación A23063T resultó en una sustitución de aminoácidos N501Y en el RBD de la proteína S, que se supone que es responsable del reconocimiento del receptor y del rango de hospedadores del SARS-CoV-2 (13, 14). (A, alanina; T, treonina; N, asparagina; Y, tirosina. En los mutantes, otros aminoácidos fueron sustituidos en ciertas ubicaciones; por ejemplo, A23063T indica que la alanina en la posición 23063 fue reemplazada por treonina). La remodelación estructural también sugirió que la sustitución de N501Y en el RBD de la proteína SARS-CoV S aumentó la afinidad de unión de la proteína a la ACE2 de ratón (Fig. 3B). La tinción de inmunofluorescencia apoyó la colocalización de la proteína ACE2 y SARS-CoV-2 S de ratón en los pulmones de ratones infectados con MASCp6 (Fig. 3C). Para seguir el rastro de la historia de adaptación de MASCp6, se analizó adicionalmente la aparición de la sustitución de N501Y mediante secuenciación profunda. Como era de esperar, todas las lecturas del aislado IME-BJ05 original fueron A23063 puro. T23063 emergió fácilmente después de un único pase en uno de los tres homogeneizados de pulmón de ratón (tabla S2), y la proporción de mutación A23063T aumentó gradualmente durante los pases posteriores (Fig. 3D). Por tanto, el aumento de la virulencia de MASCp6 del SARS-CoV-2 en ratones probablemente se atribuyó a la rápida aparición de la sustitución N501Y en el RBD de la proteína S del SARS-CoV-2.

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Fig. 3 MASCp6 lleva una sustitución de aminoácidos distinta en el RBD de la proteína Spike (S).

(UNA) Diagrama esquemático del genoma del SARS-CoV-2 y todas las mutaciones adaptativas identificadas en MASCp6. Se muestran las secuencias de aminoácidos de la cepa parental IME-BJ05 y la cepa MASCp6 adyacente a la mutación N501Y. (si) Modelado de homología de ACE2 de ratón (rosa) en complejo con SARS-CoV-2 RBD (verde) con residuo N501 (izquierda) o Y501 (derecha). (C) Colocalización de la proteína S del SARS-CoV-2 (verde) y ACE2 de ratón (rojo) en el pulmón de ratones infectados con el SARS-CoV-2. El cuadro punteado de la imagen de la izquierda se amplía en las tres imágenes de la derecha. (re) La proporción de mutación A23063T en cada paso. El umbral de mutación se definió como 1% según la puntuación de calidad media de la base secuenciada.

Validación de la eficacia protectora de una vacuna de subunidad de SARS-CoV-2 basada en RBD

Para validar la utilidad de este modelo de desafío en ratones, probamos la eficacia de protección de un candidato a vacuna de subunidad recombinante contra COVID-19. Brevemente, el SARS-CoV-2 RBD (aa 331-524) fusionado con una inmunoglobulina humana G (IgG) Fc en el extremo C (fig. S5A) se expresó en células CHO-K1 y se purificó mediante cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio aniónico en un laboratorio de buenas prácticas de laboratorio (BPL). Como era de esperar, el peso molecular del RBD-Fc recombinante fue de aproximadamente 47,98 kD, detectado con espectroscopia de masas (fig. S4B), y el análisis de citometría de flujo confirmó que el RBD-Fc, no el control Fc, se unía específicamente a la ACE2 humana expresada en celdas ACE2 / 293T estables (fig. S4C) (15).

A continuación, se inmunizaron subcutáneamente ratones hembra BALB / c con dos dosis de RBD-Fc recombinante (10 µg / ratón) en un intervalo de 2 semanas, y los ratones inmunizados con solución salina tamponada con fosfato (PBS) se establecieron como controles. Como era de esperar, en todos los ratones inmunizados con RBD-Fc se obtuvieron altos niveles de anticuerpos IgG específicos de SARS-CoV-2 (Fig. 4A) y anticuerpos de neutralización (Fig. 4B) 2 semanas después de la inmunización de refuerzo. Todos los ratones inmunizados fueron desafiados por vía intranasal con MASCp6 (1,6 × 104 PFU) y se recolectaron tejidos pulmonares para análisis virológico e histopatológico 5 días después de la exposición. Como se esperaba, todos los ratones tratados con PBS mantuvieron altas cantidades de cargas de ARN viral en el pulmón 5 días después de la exposición. Por el contrario, se observó una reducción significativa en las cargas de ARN viral (aproximadamente 0,1%) en el pulmón de ratones inmunizados con RBD-Fc en comparación con los animales de control (Fig. 4C). Además, la tinción de inmunofluorescencia para la proteína S del SARS-CoV-2 mostró que solo se detectó una pequeña población de células positivas en el pulmón de los ratones inmunizados con RBD-Fc, mientras que se observaron abundantes proteínas virales en el pulmón de los ratones inmunizados con PBS ( Figura 4D). No se observó daño patológico aparente en el pulmón de los ratones inmunizados con RBD-Fc, mientras que en el pulmón de los ratones de control se encontró lesión pulmonar inflamatoria, con inflamación focal perivascular y peribronquiolar, así como septos alveolares engrosados ​​(Fig. 4E). En conjunto, estos datos indican que nuestro modelo de ratón recientemente desarrollado con MASCp6 representa una herramienta útil para probar la eficacia de los candidatos a la vacuna COVID-19.

Adaptación de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c para probar la eficacia de la vacuna

Figura 4 Eficacia de la protección del candidato a vacuna recombinante RBD-Fc contra la exposición a MASCp6 en ratones.

(UNA) Se detectaron títulos de anticuerpos IgG específicos del SARS-CoV-2 con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas 2 semanas después de la inmunización primaria y de refuerzo, respectivamente (norte = 10 ratones por grupo). La significación estadística se analizó mediante análisis de varianza unidireccional. (si) Los títulos de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 se determinaron con el ensayo de microneutralización 2 semanas después de la inmunización de refuerzo (norte = 10 ratones por grupo). (C) Se detectaron cargas de ARN viral en el pulmón de ratones vacunados 5 días después de la exposición a MASCp6 (norte = 5 ratones por grupo). La significancia estadística se analizó mediante la t prueba. (re) Tinción por inmunofluorescencia de secciones de pulmón de ratón para proteína S (verde) y 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul). Los cuadros de puntos se amplían en la parte inferior de la misma imagen. (mi) Tinción H&E de secciones de pulmón de ratón. Se indican inflamación focal perivascular (cuadrado verde) y peribronquiolar (cuadrado amarillo) y septos alveolares engrosados ​​(flecha azul). n.s., no significativo; **PAGS <0,01, ***PAGS <0,001, ****PAGS <0,0001.

Discusión

Un modelo animal ideal para COVID-19 debería reproducir la replicación viral así como el resultado clínico observado en pacientes con COVID-19. Aquí, informamos la rápida adaptación de SARS-CoV-2 en ratones BALB / c, y la cepa MASCp6 resultante no solo se replicó de manera eficiente en la tráquea y el pulmón, sino que también causó neumonía intersticial y respuestas inflamatorias, reproduciendo muchas características clínicas observadas en COVID- 19 pacientes (dieciséis, 17). Tras la exposición a MASCp6, el SARS-CoV-2 se replicó principalmente en las vías respiratorias, y los ARN virales alcanzaron su punto máximo en los pulmones a los 3 días después de la inoculación y luego decayeron a los 5 y 7 días después de la inoculación. Este resultado fue consistente con otros modelos de ratones transgénicos o humanizados (9, 11). En particular, los ratones envejecidos desarrollaron un daño pulmonar más severo en comparación con los ratones jóvenes tras la exposición a MASCp6, lo que refleja que la mortalidad y la letalidad de COVID-19 están fuertemente sesgadas hacia los ancianos (18). La muerte solo fue reportada por Jiang et al. (10) en ratones transgénicos ACE2 infectados con SARS-CoV-2. En nuestro modelo de desafío, no se registraron síntomas clínicos visibles ni pérdida de peso corporal a lo largo de los experimentos (fig. S4). La dosis de desafío utilizada en nuestro experimento fue de 1,6 × 104 PFU; por tanto, queda por determinar si una dosis de exposición más alta de MASCp6 exacerbaría la patología.

El desarrollo de un modelo de desafío basado en cepas adaptado a ratones ha sido bien demostrado en estudios de SARS-CoV y MERS-CoV (12, 19, 20). El paso en serie del virus en los pulmones de los ratones da como resultado mutaciones adaptativas que aumentan la infectividad viral. El genoma de MASCp6 contiene cinco mutaciones en comparación con su cepa parental IME-BJ05, y estas mutaciones dieron como resultado cuatro cambios de residuos de aminoácidos en los genes ORF1ab, S y N, respectivamente (Fig. 3A). La mutación N501Y parece proporcionar una interacción más favorable con ACE2 de ratón para el acoplamiento y la entrada, lo que conduce a un aumento del fenotipo de virulencia en ratones. Queda por determinar si las otras tres mutaciones, a excepción de N501Y, también regulan la infectividad viral. Una mayor investigación con genética inversa aclarará este problema y podría permitir la síntesis rápida de un SARS-CoV-2 recombinante con mayor virulencia (21, 22). Además, los resultados de la inmunotinción mostraron que las células del club de pulmón y las células AT2 son las principales células diana de MASCp6, lo que está de acuerdo con los hallazgos anteriores de modelos animales y pacientes con COVID-19 (11, 23, 24).

En comparación con los ratones transgénicos o humanizados ACE2 descritos anteriormente, nuestro modelo de desafío basado en MASCp6 utiliza ratones inmunocompetentes de tipo salvaje y se puede aplicar directamente a la evaluación de la eficacia de varias vacunas candidatas. La inmunización con la subunidad recombinante candidata a vacuna (RBD-Fc) indujo altos niveles (hasta 1: 320) de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2, casi eliminando la replicación del ARN viral en pulmones de ratón después de la exposición a MASCp6 (Fig.4, B y C). La posible correlación entre los títulos de anticuerpos neutralizantes del suero en los ratones vacunados y la eficacia protectora destaca la versatilidad de este modelo animal conveniente y económico. Recientemente, los primates no humanos, que son los más cercanos a los humanos filogenéticamente, también se han utilizado para reproducir la infección por SARS-CoV-2, y se han validado varias vacunas candidatas con una eficacia de protección prometedora (2527). Los hámsteres, hurones y gatos también son permisivos con la infección por SARS-CoV-2 (2830), y el resultado clínico varía desde una infección asintomática hasta lesiones pulmonares patológicas graves después de la infección por SARS-CoV-2. Actualmente, ningún modelo animal para el SARS-CoV-2 reproduce todos los aspectos de la enfermedad humana. Por lo tanto, el establecimiento de diferentes modelos animales debería ampliar en gran medida nuestra comprensión de la transmisión y patogénesis del SARS-CoV-2 y acelerar el desarrollo de contramedidas contra COVID-19.

Expresiones de gratitud: Agradecemos a X. D. Yu y J. J. Zhao por su excelente apoyo técnico y de bioseguridad. Fondos: Este trabajo fue apoyado por el National Key Plan for Scientific Research and Development of China (2016YFD0500304, 2016YFD0500306 y 2020YFA0707801), la National Natural Science Foundation of China (82041006 y 82041025), el National Science and Technology Major Project of China (2018ZX09711003 y 2017ZX10304402003) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología Municipal de Beijing (Z201100001020004). C.-F.Q. fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Distinguidos (81925025), el Grupo de Investigación Innovadora (81621005) de la NSFC y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-049). Contribuciones de autor: HG, SS, QC, GY, LH, HF, Y.-QD, YW, YT, ZZ, YC, Yu.L., X.-FL, JL, NN..Z., XY, SC, GZ, GH , D.-YL y YG experimentos realizados; X.W., H.W., X.Y., Ya.L., Y.H., X.Z., S.G. y X.S. datos analizados; Y.Z. y C.-F.Q. concibió el proyecto y diseñó los experimentos. Y.Z., C.F.Q., S.S. y S.J. supervisó el estudio y redactó el manuscrito con el aporte de todos los coautores. Conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Disponibilidad de datos y materiales: La secuencia del genoma de IME-BJ05 y MASCp6 se ha depositado en el Genome Warehouse del National Genomics Data Center (https://bigd.big.ac.cn/gwh), BIG, CAS, con los números de acceso. GWHACBB01000000.2 y GWHACFH00000000, respectivamente. Todas las solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse a C.-F.Q. ([email protected] o [email protected]) y se cumplirá después de completar un acuerdo de transferencia de materiales. Este trabajo está autorizado bajo una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0), que permite el uso, la distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente. Para ver una copia de esta licencia, visite https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Esta licencia no se aplica a figuras / fotografías / obras de arte u otro contenido incluido en el artículo que se acredite a un tercero; obtener la autorización del titular de los derechos antes de utilizar dicho material.

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