Sistemas de evaluación biológica de la inmunidad a la infección por COVID-19 leve versus grave en humanos

Perfil inmunológico de pacientes con COVID-19

La enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) ha afectado a millones de personas en todo el mundo, pero no está claro cómo el sistema inmunológico humano responde e influye en la gravedad del COVID-19. Mateo et al. presentar un atlas completo de modulación inmunológica asociada con COVID-19. Realizaron citometría de flujo de alta dimensión de pacientes COVID-19 hospitalizados y encontraron tres inmunotipos prominentes y distintos que están relacionados con la gravedad de la enfermedad y los parámetros clínicos. Arunachalam et al. informan sobre un enfoque de biología de sistemas para evaluar el sistema inmunológico de pacientes con COVID-19 con enfermedad de leve a grave. Estos estudios proporcionan un compendio de información sobre células inmunitarias y hojas de ruta para posibles intervenciones terapéuticas.

Ciencias, este número p. eabc8511, pág. 1210

Resumen

La enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) representa una crisis mundial, pero aún quedan importantes lagunas de conocimiento sobre la inmunidad humana al síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Analizamos las respuestas inmunes en 76 pacientes con COVID-19 y 69 individuos sanos de Hong Kong y Atlanta, Georgia, Estados Unidos. En las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con COVID-19, observamos una expresión reducida del antígeno leucocitario humano de clase DR (HLA-DR) y citocinas proinflamatorias por parte de las células mieloides, así como una alteración de la señalización e interferón de la diana de rapamicina (mTOR) en mamíferos. Producción de -α (IFN-α) por células dendríticas plasmocitoides. Por el contrario, detectamos niveles plasmáticos mejorados de mediadores inflamatorios, incluidos EN-RAGE, TNFSF14 y oncostatina M, que se correlacionaron con la gravedad de la enfermedad y el aumento de productos bacterianos en el plasma. La transcriptómica unicelular reveló una falta de IFN de tipo I, HLA-DR reducido en las células mieloides de pacientes con COVID-19 grave y expresión transitoria de genes estimulados por IFN. Esto fue consistente con la transcriptómica masiva de PBMC y los niveles bajos de IFN-α en plasma durante la infección. Estos resultados revelan mecanismos y posibles dianas terapéuticas para COVID-19.

La reciente aparición del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en Wuhan, China, en diciembre de 2019 y su rápida propagación internacional causaron una pandemia global. La investigación ha avanzado rápidamente en el aislamiento, secuenciación y clonación del virus; desarrollo de kits de diagnóstico; y prueba de vacunas candidatas. Sin embargo, quedan preguntas clave sobre la interacción dinámica entre el sistema inmunológico humano y el virus SARS-CoV-2.

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) se presenta con un espectro de fenotipos clínicos, la mayoría de los pacientes presentan síntomas leves a moderados y el 15% de los pacientes progresa, típicamente en una semana, a una enfermedad grave o crítica que requiere hospitalización (1). Una minoría de los hospitalizados desarrolla el síndrome de enfermedad respiratoria aguda (SDRA) y requiere ventilación mecánica. Los datos epidemiológicos hasta ahora sugieren que COVID-19 tiene una tasa de letalidad varias veces mayor que la de la influenza estacional (1). Los ancianos y las personas con comorbilidades médicas subyacentes, como enfermedades cardiovasculares, diabetes mellitus, enfermedad pulmonar crónica, enfermedad renal crónica, obesidad, hipertensión o cáncer tienen una tasa de mortalidad mucho más alta que los adultos jóvenes sanos (2). Se desconocen las causas subyacentes de esta diferencia, pero pueden deberse a una respuesta deficiente al interferón (IFN) y respuestas inflamatorias desreguladas, como se ha observado con otras infecciones zoonóticas por coronavirus, como el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el síndrome respiratorio de Oriente Medio. (MERS) (3). La investigación actual está descubriendo cómo se induce la respuesta inmune adaptativa al SARS-CoV-2 con capacidades funcionales óptimas para eliminar la infección viral del SARS-CoV-2 (46).

Comprender los mecanismos inmunológicos subyacentes a las diversas presentaciones clínicas de COVID-19 es un paso crucial en el diseño de estrategias terapéuticas racionales. Estudios recientes han sugerido que los pacientes con COVID-19 se caracterizan por linfopenia y un mayor número de neutrófilos (79). La mayoría de los pacientes con COVID-19 severo exhiben niveles mejorados de citocinas proinflamatorias que incluyen interleucina-6 (IL-6) e IL-1β, así como MCP-1, IP-10 y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) en el el plasma10). Se ha propuesto que niveles altos de citocinas proinflamatorias pueden provocar shock, así como insuficiencia respiratoria o insuficiencia orgánica múltiple, y se están realizando varios ensayos para evaluar mediadores inflamatorios (11). Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos inmunológicos que subyacen a la gravedad de COVID-19 y el grado en que difieren de las respuestas inmunes a otros virus respiratorios. Además, sigue sin conocerse la cuestión de si los individuos de diferentes partes del mundo responden de manera diferente al SARS-CoV-2. En este estudio, utilizamos un enfoque biológico de sistemas [mass cytometry and single-cell transcriptomics of leukocytes, transcriptomics of bulk peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and multiplex analysis of cytokines in plasma] analizar la respuesta inmune en 76 pacientes con COVID-19 y 69 controles emparejados por edad y sexo de dos cohortes geográficamente distantes.

Análisis de leucocitos de sangre periférica de pacientes con COVID-19 mediante citometría de masas

Se obtuvieron muestras de pacientes infectados con COVID-19 y muestras de controles sanos emparejados por edad y sexo de dos cohortes independientes: (i) el Hospital Princess Margaret en la Universidad de Hong Kong y (ii) la Clínica Hope en la Universidad Emory en Atlanta, Georgia , Estados Unidos. Las características de los pacientes y los diferentes ensayos realizados se muestran en la Tabla 1. Utilizamos citometría de masas para evaluar las respuestas inmunes a la infección por SARS-CoV-2 en 52 pacientes con COVID-19, que fueron confirmados positivos para ARN viral mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). y 62 controles sanos emparejados por edad y sexo distribuidos entre las dos cohortes. Para caracterizar los fenotipos de células inmunes en las PBMC, utilizamos un panel de fosfo-CyTOF que incluye 22 marcadores de superficie celular y 12 marcadores intracelulares contra una variedad de quinasas y epítopos fosfoespecíficos de moléculas de señalización y H3K27ac, un marcador de modificación de histonas que impulsa la remodelación epigenética. (12, 13) (tabla S1). La estrategia experimental se describe en la Fig. 1A. El fosfo-CyTOF identificó 12 subtipos principales de células inmunes innatas y adaptativas en ambas cohortes, como se representa en los gráficos de incrustación de vecinos estocásticos con distribución t (t-SNE) (Fig. 1B). Hubo un aumento notable en la frecuencia de plasmoblastos y células T CD8 efectoras en todos los individuos infectados (Fig.1B) en ambas cohortes, como se ha descrito recientemente en otros estudios (6, 8, 14). Es de destacar que la cinética de la respuesta de las células T efectoras CD8 se prolongó y continuó aumentando hasta el día 40 después de la aparición de los síntomas (fig. S1).

tabla 1 Características de los pacientes y número de muestras utilizadas en diferentes ensayos.

NA, no aplica.

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Figura 1 Análisis de citometría de masas de leucocitos de sangre periférica humana de pacientes con COVID-19.

(UNA) Una representación esquemática de la estrategia experimental. PFA, paraformaldehído. (si) Representación de agrupaciones de células identificadas por citometría de masas visualizadas por t-SNE en un espacio bidimensional. Los diagramas de caja en la parte inferior muestran la frecuencia de plasmablastos (CD3, CD20, CD56, HLA-DR+, CD14, CD16, CD11c, CD123, CD19lo, CD27Holay CD38Hola) y células T CD8 efectoras (CD3+, CD8+, CD38Holay HLA-DRHola) en ambas cohortes. (C) Frecuencias de pDC (CD3, CD20, CD56, HLA-DR+, CD14, CD16, CD11cy CD123+) en individuos sanos e infectados por COVID-19 en ambas cohortes. (re y mi) Diagramas de caja que muestran el cambio de veces (FC) de la tinción de pS6 en las pDC (D) y la tinción de IκBα en las mDC (E) en relación con las medianas de los controles sanos. Los histogramas de la derecha representan tinciones representativas de los mismos. (F) Características distintivas [false discovery rate (FDR) < 0.01] a través del análisis de modelos lineales de los datos de citometría de masas entre sujetos sanos e infectados. En todos los diagramas de caja, las cajas muestran los cuartiles medio, superior e inferior. Los bigotes muestran percentiles del 5 al 95. Cada punto representa una muestra individual (saludable: norte = 17 y 45; infectado: norte = 19 y 54, para las cohortes de Atlanta y Hong Kong, respectivamente). Para el análisis t-SNE, norte = 34 y 60 para las cohortes de Atlanta y Hong Kong, respectivamente. Los colores de los puntos indican la gravedad de la enfermedad clínica, como se muestra en las leyendas. Las diferencias entre los grupos se midieron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney (Wilcoxon, emparejado = FALSO). los PAGS los valores que representan la importancia se muestran dentro de los diagramas de caja.

A continuación, utilizamos la activación manual para identificar 25 subconjuntos de células inmunitarias (fig. S2) y determinamos si había cambios en la frecuencia o en las moléculas de señalización de las poblaciones de células inmunitarias innatas consistentes entre las dos cohortes. Hubo varias diferencias, pero notablemente la frecuencia de células dendríticas plasmocitoides (pDC) se redujo significativamente en las PBMC de los individuos infectados con SARS-CoV-2 en ambas cohortes (Fig. 1C). La cinética de la respuesta de pDC no mostró una asociación con el tiempo desde el inicio de los síntomas (fig. S1C). Los cambios observados tampoco se correlacionaron con la gravedad clínica de la infección (fig. S1). Además, se redujo la expresión de pS6[(proteínaribosomalfosforiladaS6)unobjetivocanónicodelaactivacióndeladianaderapamicina(mTOR)enmamíferos([(phosphorylatedribosomalproteinS6)acanonicaltargetofmammaliantargetofrapamycin(mTOR)activation([(proteínaribosomalfosforiladaS6)unobjetivocanónicodelaactivacióndeladianaderapamicina(mTOR)enmamíferos([(phosphorylatedribosomalproteinS6)acanonicaltargetofmammaliantargetofrapamycin(mTOR)activation(15)]en pDC y disminución de IκBα, un inhibidor de la señalización del factor de transcripción NF-κβ, en células dendríticas mieloides (mDC) (Fig. 1, D y E). Se sabe que la señalización de mTOR media la producción de interferón-α (IFN-α) en pDC (dieciséis), lo que sugiere que los pDC pueden verse alterados en su capacidad de producir IFN-α en pacientes con COVID-19. Finalmente, utilizamos un enfoque de modelado lineal para detectar características que distinguen a los individuos sanos de los infectados y los que discriminan a los individuos en función de la gravedad clínica del COVID-19. Este análisis se realizó con la cohorte (Hong Kong o Atlanta) como covariable para identificar solo las características que eran consistentes en ambas cohortes. Las características distintivas entre individuos sanos e infectados se muestran en la Fig. 1F. Estos incluyen frecuencias de plasmoblastos y células T efectoras y los cambios en las células inmunes innatas descritos anteriormente además de STAT1 (transductor de señal y activador de la transcripción 1) y otros eventos de señalización en células T y células asesinas naturales (NK). Es de destacar que ninguna característica fue significativamente diferente entre los grupos de gravedad clínica.

Además, examinamos el efecto de diversas intervenciones terapéuticas sobre las respuestas inmunitarias utilizando muestras de la cohorte de Hong Kong, en la que algunos pacientes fueron tratados con IFN-β1, corticosteroides o antivirales. Los individuos infectados, independientemente de la intervención, mostraron un aumento de la frecuencia de células T de plasmablastos y de células T CD8 efectoras en comparación con los controles sanos (fig. S3). Sin embargo, hubo una frecuencia aumentada de células T CD8 efectoras (figura S3, panel inferior, columna derecha) y una señal de pS6 disminuida en las pDC de los individuos tratados con antivirales (figura S4).

COVID-19 da como resultado un deterioro funcional de las células mieloides sanguíneas y pDC

Dados los hallazgos anteriores de que la señalización de mTOR en pDCs media la producción de IFN-α en respuesta a la estimulación del receptor Toll-like (TLR) (dieciséis), la expresión reducida de pS6 en pDC sugiere que dichas células pueden verse afectadas en su capacidad para producir IFN-α. Para probar esto, realizamos la estimulación ex vivo de PBMC de individuos sanos o infectados con COVID-19, utilizando una mezcla de TLR7 y TLR 8 sintéticos (TLR7 / 8) y ligandos TLR3, que se sabe que se expresan por virus, y nosotros realizó un ensayo de tinción intracelular para detectar respuestas de citocinas. Los ligandos TLR incluían ligandos TLR3 y TLR7 / 8, polyIC y R848. De acuerdo con nuestra hipótesis, hubo una producción reducida de IFN-α en respuesta a los estímulos de TLR en las pDC de los individuos infectados en comparación con los de los controles sanos (Fig. 2A). La respuesta de TNF-α también se redujo significativamente en las pDC de los individuos infectados, lo que demuestra que las pDC están funcionalmente deterioradas en la infección por COVID-19. También determinamos la capacidad de mDC y CD14+ monocitos para responder a estímulos TLR. En particular, la respuesta en las CDm y en los monocitos también fue significativamente menor en respuesta a la estimulación con un cóctel de ligandos bacterianos (compuesto de ligandos TLR2, TLR4 y TLR5) o con el cóctel de TLR vírico (Fig. 2B y Fig. S5). ). Además, los niveles reducidos de IκBα no se tradujeron en una fosforilación mejorada de la subunidad p65 de NF-κβ medida por p65 (Ser529) en las mismas celdas (Fig. 2C). Estos resultados sugieren que las células inmunes innatas en la periferia de los individuos infectados con COVID-19 se suprimen en su respuesta a la estimulación de TLR, independientemente de la gravedad clínica.

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Figura 2 Análisis de citometría de flujo de leucocitos de sangre periférica humana estimulados ex vivo de pacientes con COVID-19.

(UNA) Diagramas de caja que muestran la fracción de pDC en PBMC de donantes sanos o infectados (CD3, CD20, CD56, HLA-DR+, CD14, CD16, CD11cy CD123+) que producen IFN-α, TNF-α o IFN-α + TNF-α en respuesta a la estimulación con el cóctel viral (polyIC + R848). Los gráficos de contorno de la derecha muestran tinción con IFN-α, TNF-α o IFN-α + TNF-α en pDC. (si) Diagramas de caja que muestran la fracción de CDm en PBMC de donantes sanos o infectados (CD3, CD20, CD56, HLA-DR+, CD14, CD16, CD123+y CD11c) que produce IL-6, TNF-α o IL-6 + TNF-α en respuesta a la falta de estimulación (arriba), el cóctel bacteriano (medio; Pam3CSK4, LPS y Flagelina) o el cóctel viral (abajo; polyIC + R848). Los gráficos de citometría de flujo a la derecha son gráficos representativos seleccionados en mDC que muestran la respuesta de IL-6, TNF-α o IL-6 + TNF-α. (C) Doble cambio de NF-κβ p65 (Ser529) tinción en PBMC estimuladas con cóctel bacteriano en relación con ninguna estimulación en donantes sanos e infectados para mostrar la inducción reducida de la fosforilación de p65 en individuos infectados. Los histogramas muestran gráficos de citometría de flujo representativos de la tinción de p65 en mDC. GeoMFI, intensidad de fluorescencia media geométrica. En todos los diagramas de caja, las cajas muestran los cuartiles medio, superior e inferior. Los bigotes muestran percentiles del 5 al 95. Cada punto representa un paciente de la cohorte de Atlanta (norte = 14 y 17 para sanos e infectados, respectivamente). Los colores de los puntos indican la gravedad de la enfermedad clínica, como se muestra en las leyendas. Las diferencias entre los grupos se midieron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. los PAGS los valores que representan la importancia se muestran dentro de los diagramas de caja.

Concentraciones mejoradas de citocinas y mediadores inflamatorios en plasma de pacientes con COVID-19

La alteración de la respuesta de citocinas de las células mieloides y las pDC en respuesta a la estimulación de TLR fue inesperada y aparentemente en desacuerdo con la literatura que describe una respuesta inflamatoria mejorada en individuos infectados con COVID-19. Varios estudios han descrito niveles plasmáticos más altos de citocinas, que incluyen, entre otros, IL-6, TNF-α y CXCL10 (10, 1719). Por lo tanto, evaluamos las citocinas y quimiocinas en muestras de plasma de la cohorte de Atlanta utilizando el panel de inflamación multiplex de Olink que mide 92 citocinas y quimiocinas diferentes. De los 92 analitos medidos, se detectaron 71 proteínas dentro del rango dinámico del ensayo. De estas 71 proteínas, 43 citocinas, incluidas IL-6, MCP-3 y CXCL10, se regularon significativamente al alza en la infección por COVID-19 (Fig. 3, fila superior y Fig. S6). Estos resultados demuestran que los niveles plasmáticos de moléculas inflamatorias se regularon significativamente al alza, a pesar de la respuesta alterada de citocinas en células mieloides sanguíneas y pDC, lo que sugiere un origen tisular de las citocinas plasmáticas.

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Fig. 3 Análisis multiplex de citocinas en el plasma de pacientes con COVID-19.

Niveles de citocinas en el plasma de individuos sanos o infectados. Los individuos infectados se clasifican además sobre la base de la gravedad de su enfermedad COVID-19 clínica. Los valores de expresión de proteínas normalizados representados en la y Los ejes son unidades arbitrarias definidas por Olink Proteomics para representar los datos de Olink. En todos los diagramas de caja, las cajas muestran los cuartiles medio, superior e inferior. Los bigotes muestran percentiles del 5 al 95. Cada punto representa una muestra de cohorte de Atlanta (norte = 18 sanos, 4 moderados, 18 graves, 12 UCI, 2 convalecientes, 8 con gripe y 11 VSR). Los colores de los puntos indican la gravedad de la enfermedad clínica, como se muestra en las leyendas. Las diferencias entre los grupos se midieron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney (Wilcoxon, emparejado = FALSO; *PAGS <0,05; **PAGS <0,01; ***PAGS <0,001; ns, no significativo).

Además de IL-6 y otras citocinas descritas anteriormente (10), identificamos tres proteínas que se mejoraron significativamente en la infección por COVID-19 y se correlacionaron fuertemente con la gravedad clínica (Fig. 3, fila inferior). Estos fueron TNFSF14[LIGHTunligandodelreceptordelinfotoxinaBqueestáaltamenteexpresadoenfibroblastosdepulmónhumanoeimplicadoenlafibrosisyremodelacióneinflamacióndeltejidopulmonar([LIGHTaligandoflymphotoxinBreceptorthatishighlyexpressedinhumanlungfibroblastsandimplicatedinlungtissuefibrosisandremodelingandinflammation([LIGHTunligandodelreceptordelinfotoxinaBqueestáaltamenteexpresadoenfibroblastosdepulmónhumanoeimplicadoenlafibrosisyremodelacióneinflamacióndeltejidopulmonar([LIGHTaligandoflymphotoxinBreceptorthatishighlyexpressedinhumanlungfibroblastsandimplicatedinlungtissuefibrosisandremodelingandinflammation(20)], EN-RAGE[S100A12unbiomarcadordelesiónpulmonarqueestáimplicadoenlapatogénesisdelSDRAinducidoporsepsis([S100A12abiomarkerofpulmonaryinjurythatisimplicatedinpathogenesisofsepsis-inducedARDS([S100A12unbiomarcadordelesiónpulmonarqueestáimplicadoenlapatogénesisdelSDRAinducidoporsepsis([S100A12abiomarkerofpulmonaryinjurythatisimplicatedinpathogenesisofsepsis-inducedARDS(21)]y oncostatina M [(OSM), a regulator of IL-6]. Es de destacar que el TNFSF14 se mejora de forma distintiva en el plasma de las personas infectadas con COVID-19, pero no en los casos de otras infecciones pulmonares relacionadas, como el virus de la influenza (gripe) y el virus sincitial respiratorio (RSV) (Fig. 3). Dadas las observaciones pronunciadas y poco apreciadas de las concentraciones plasmáticas mejoradas de TNFSF14, EN-RAGE y OSM y su correlación con la gravedad de la enfermedad, utilizamos un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para validar de forma independiente estos resultados. De acuerdo con el análisis multiplex de Olink, encontramos un aumento significativo de estos mediadores inflamatorios en el plasma de pacientes con COVID-19 en la unidad de cuidados intensivos y severos (UCI). Además, encontramos una correlación entre el análisis multiplex de Olink y los resultados de ELISA (fig. S7). Estos resultados sugieren que la infección por COVID-19 induce un programa inflamatorio distintivo caracterizado por citocinas liberadas de los tejidos (muy probablemente los pulmones) pero la supresión del sistema inmunológico innato en la periferia. Estas observaciones también pueden representar estrategias terapéuticas previamente inexploradas para la intervención contra COVID-19 grave.

Respuesta transcripcional unicelular a la infección por COVID-19

Para investigar los procesos moleculares y celulares que conducen al programa inflamatorio distintivo, utilizamos la indexación celular de transcriptomas y epítopos por secuenciación (CITE-seq) y perfilamos la expresión de genes y proteínas en muestras de PBMC de individuos infectados con COVID-19. Las muestras de PBMC criopreservadas de un total de 12 sujetos de la misma edad en la cohorte de Atlanta (cinco controles sanos y siete pacientes con COVID-19; Tabla 2) se enriquecieron para CD, teñidas con un cóctel de 36 anticuerpos marcados con ADN (tabla S2), y analizados usando enfoques de perfiles de expresión génica unicelular basados ​​en gotas (Fig. 4A). Realizamos el experimento en dos lotes y obtuvimos transcriptomas de más de 63.000 células después del preprocesamiento inicial. A continuación, generamos una matriz de célula por gen y realizamos la reducción de dimensionalidad a través de la aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) y la agrupación basada en gráficos. El análisis de la distribución celular dentro del UMAP entre experimentos no reveló diferencias importantes y analizamos los conjuntos de datos de los dos experimentos juntos sin corrección por lotes (fig. S8). A continuación, calculamos las métricas de control de calidad (QC) por célula (fig. S9), genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en cada grupo en comparación con todas las demás células (fig. S10 y tabla S4) y la abundancia de ADN marcado anticuerpos en cada célula (fig. S11). Con esta información, filtramos las celdas de baja calidad y anotamos manualmente los grupos. Después del control de calidad y la anotación de grupos, conservamos un conjunto de datos final con 57.669 transcriptomas de alta calidad y una mediana de ~ 4781 células por muestra y 1803 genes individuales por célula que usamos para construir el paisaje de células inmunes unicelulares de COVID-19 (Fig. .4B).

Tabla 2 Características detalladas de las muestras de pacientes utilizadas en el análisis CITE-seq.

Los guiones indican que la información no es aplicable. dic., fallecido; F, mujer; M, hombre; B, negro; W, blanco.

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Figura 4 Expresión temprana y transitoria de ISG en la infección por COVID-19.

(UNA) Una representación esquemática de la estrategia de enriquecimiento de DC utilizada en el análisis CITE-seq. (si) Representación UMAP de PBMC de todas las muestras analizadas (norte = 12), coloreado por tipo de celda anotado manualmente. (C) Comparación por pares de genes de individuos sanos (norte = 5) y pacientes infectados por COVID-19 (norte = 7) se realizó para cada grupo. Se analizaron los DEG para determinar la sobrerrepresentación de BTM. El diagrama de anillo muestra vías sobrerrepresentadas en genes regulados hacia arriba y hacia abajo de cada grupo. El mapa de calor de la derecha muestra los niveles de expresión promedio de 33 ISG derivados de los BTM enriquecidos en diferentes grupos de células de (norte = 5) y sujetos COVID-19 (norte = 7). (re) Representación UMAP de PBMC de todas las muestras analizadas que muestran los niveles de expresión de IFN e ISG seleccionados. (mi) Cinética de los niveles circulantes de IFN-α (femtogramos por mililitro) en plasma medidos con tecnología SIMoA (norte = 18 pacientes sanos y 40 infectados por COVID-19). (F) Correlación entre los niveles circulantes de IFN-α en plasma y la expresión media de ISG medida por análisis CITE-seq. (GRAMO) Mapa de calor jerárquicamente agrupado de la expresión de la firma ISG de CITE-seq (C) en el conjunto de datos de RNA-seq a granel, realizado utilizando un grupo extendido de sujetos (norte = 17 muestras sanas y 17 infectadas con COVID-19). Los colores representan genes z puntuaciones. (H) Gráfico de barras que representa la proporción de varianza en la expresión de firma de CITE-seq ISG explicada por las covariables en el X eje a través del análisis de componentes de varianza principal (PVCA). resid, residual. (figura en la página siguiente)

Observamos varios grupos que se identificaron principalmente en individuos infectados con COVID-19, incluida una población de plasmablastos, plaquetas y glóbulos rojos y varias poblaciones de granulocitos. En particular, detectamos grupos de células T y monocitos que se caracterizaron por la expresión de genes estimulados por interferón (ISG) como IFI27, IFITM3 o ISG15 (ver C11-C MONO_IFN y C18-T_IFN en la figura S10). Estos grupos enriquecidos con respuesta a IFN surgieron sólo en muestras de pacientes con COVID-19 (fig. S12).

Para describir el estado transcripcional específico de células individuales de individuos infectados con COVID-19, determinamos los DEG para las células de todas las muestras infectadas con COVID-19 en un grupo dado en comparación con las células de todos los individuos sanos en el mismo grupo. Luego analizamos estos DEG con análisis de sobrerrepresentación utilizando módulos transcripcionales de sangre (BTM) (22) para comprender mejor qué vías inmunes están reguladas diferencialmente en pacientes con COVID-19 en comparación con individuos sanos (Fig. 4C y Fig. S13). El análisis indicó una marcada inducción de BTM antivirales, especialmente en tipos de células pertenecientes al linaje de células mieloides y dendríticas. El análisis detallado del patrón de expresión de la unión distinta de genes que impulsan el enriquecimiento de estas vías antivirales en monocitos y células dendríticas reveló que muchos ISG estaban regulados positivamente en estos tipos de células (Fig. 4C, mapa de calor). Dadas nuestras observaciones de la producción de IFN-α silenciado en pDC (Fig. 2A), investigamos la expresión de genes que codifican varios IFN de tipo I y tipo II a través de tipos de células (Fig. 4D y Fig. S14). En particular, con la excepción de niveles modestos de expresión de IFN-γ en células T y NK, no pudimos detectar ninguna expresión de genes de IFN-α y -β, lo cual es consistente con los datos funcionales que demuestran la producción alterada de IFN tipo I por pDC y células mieloides (Fig. 2). Sin embargo, hubo una expresión mejorada de ISG en pacientes con COVID-19 (Fig. 4D) a pesar de una capacidad alterada de las células innatas en el compartimento sanguíneo para producir estas citocinas.

A pesar de la falta de expresión del gen de IFN de tipo I, la presencia de una firma ISG en las PBMC de los individuos infectados con COVID-19 planteó la posibilidad de que cantidades bajas de IFN de tipo I producidas en el pulmón por la infección por SARS-CoV-2 (17) podría circular en el plasma e inducir la expresión de ISG en PBMC. Por lo tanto, medimos la concentración de IFN-α en plasma utilizando un ELISA altamente sensible habilitado por la tecnología de matriz de molécula única (SIMoA). Observamos un marcado aumento en la concentración de IFN-α, que alcanzó su punto máximo alrededor del día 8 después del inicio de los síntomas y retrocedió a los niveles basales el día 20 (Fig. 4E). En particular, observamos una fuerte correlación entre los niveles de expresión promedio de la firma ISG en PBMC identificadas por análisis CITE-seq y la concentración de IFN-α en plasma (Fig. 4F). Además, notamos una fuerte dependencia temporal de la respuesta de IFN-α.

Para investigar esto más a fondo y para validar de forma independiente las observaciones en el análisis CITE-seq, realizamos un análisis de secuenciación de ARN en masa (ARN-seq) de PBMC en un grupo extendido de sujetos (17 pacientes con COVID-19 y 17 controles sanos) de la misma grupo. Primero evaluamos si la firma ISG que contiene 33 genes identificados en los datos de CITE-seq también se observó en el conjunto de datos de RNA-seq a granel. También observamos una fuerte inducción de los ISG en sujetos COVID-19 en comparación con donantes sanos en este conjunto de datos (Fig. 4G). Es de destacar que no detectamos la expresión de genes que codifican IFN-α o IFN-β, de acuerdo con los experimentos de citometría de flujo y CITE-seq (Fig. 4D y Fig. 2, respectivamente). También realizamos un análisis imparcial de un conjunto extendido de genes en la red transcripcional de IFN (23) y encontraron que estos fueron inducidos en sujetos con COVID-19 en relación con controles sanos, como se observa para la firma ISG limitada (fig. S15A). De manera similar a la observación con datos de CITE-seq (Fig. 4F), hubo una fuerte correlación entre el IFN-α circulante y la respuesta ISG medida por la transcriptómica en masa (Fig. S15B). Además, analizamos el impacto individual de las principales covariables (tiempo, gravedad de la enfermedad, sexo y edad) en la firma ISG observada. Aunque el tiempo emergió como el principal impulsor de la firma ISG, la gravedad clínica de COVID-19 también tuvo un efecto (Fig. 4H y Fig. S15C). En conjunto, estos datos demuestran que, en las primeras etapas de la infección por SARS-CoV-2, hay niveles bajos de IFN-α circulante que inducen ISG en la periferia, mientras que las células inmunitarias innatas de la periferia están deterioradas en su capacidad de producir citocinas inflamatorias.

Además de una firma ISG mejorada, el análisis CITE-seq reveló una disminución significativa en la expresión de genes implicados en las vías de presentación de antígeno en células mieloides (Fig. 4C y Fig. S13). De acuerdo con esto, observamos una reducción en la expresión de las proteínas CD86 y del antígeno leucocitario humano clase DR (HLA-DR) en monocitos y CDm de pacientes con COVID-19, que fue más pronunciada en sujetos con infección grave por COVID-19 (Fig. .5A y fig. S16A). HLA-DR es un mediador importante de la presentación de antígenos y es crucial para la inducción de respuestas de células T colaboradoras. Utilizando los datos de fosfo-CyTOF de las cohortes de Atlanta y Hong Kong, confirmamos la expresión reducida de HLA-DR en monocitos y CDm en pacientes con enfermedad grave por COVID-19 (Fig. 5B). Por el contrario, S100A12, el gen que codifica EN-RAGE, aumentó sustancialmente en las PBMC de los pacientes con COVID-19, mientras que la expresión de genes que codifican otras citocinas proinflamatorias estuvo ausente o sin cambios en comparación con los controles sanos (Fig. 5C y Fig. S16B). ). En particular, la expresión de S100A12 estaba muy restringida a grupos de monocitos (Fig. 5D) y mostró una correlación significativa con los niveles de proteína EN-RAGE en plasma medidos por Olink (Fig. 5E). Finalmente, examinamos si existe una asociación entre la expresión de HLA-DR y S100A12 en nuestro conjunto de datos, y encontramos una fuerte correlación inversa entre la expresión del gen S100A12 y los genes que codifican la maquinaria de presentación de antígenos (HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA- DR y CD74) (Fig. 5F y fig. S17). En particular, el receptor para S100A12, AGER (RAGE), se expresó escasamente en PBMC (fig. S18), lo que sugiere que es probable que el objetivo de la acción de EN-RAGE esté en otro lugar, tal vez en el pulmón, donde se sabe que se expresa RAGE. en las células epiteliales alveolares de tipo I y median la inflamación (24).

Sistemas de evaluación biológica de la inmunidad a la infección por COVID-19 leve versus grave en humanos

Figura 5 Respuesta inflamatoria atenuada en células inmunitarias innatas periféricas de pacientes con COVID-19.

(UNA) Análisis de citometría de flujo de PBMC analizadas en paralelo al experimento CITE-seq. El registro10 Se muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de HLA-DR. (si) Intensidad mediana de la expresión de HLA-DR en el experimento de fosfo-CyTOF de la Fig. 1. Los cuadrados representan muestras individuales [Hong Kong (HK): healthy = 30, moderate = 15, and severe = 10; and Atlanta: healthy = 17, moderate = 4, and severe = 13]. Los recuadros indican los cuartiles medio, superior e inferior. La longitud del bigote es 1,5 veces el rango intercuartílico. (C) Expresión relativa (Rel.) De genes que codifican diferentes citocinas en el conjunto de datos de la secuencia de ARN en masa. Los recuadros muestran los cuartiles medio, superior e inferior, y los bigotes muestran los percentiles 5 a 95. (re) Representación UMAP de la expresión de S100A12 en PBMC de todas las muestras analizadas por CITE-seq. (mi y F) Análisis de correlación (Cor) de la expresión de S100A12 en células de grupos de células mieloides y dendríticas (C MONO_1, NC MONO, CDC2, PDC, C MONO_IFN, C MONO_2 y C MONO_3) con niveles de EN-RAGE en plasma (E) o HLA -Expresión de DPA1 en los mismos clústeres (F) (norte = 5 sujetos sanos y 7 con COVID-19). La significación estadística entre los grupos en (B) y (C) se determinó mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney bilateral; *PAGS <0,05; **PAGS <0,01; ***PAGS <0,001.

Tomados en conjunto, el análisis CITE-seq de PBMC en pacientes con COVID-19 reveló los siguientes conocimientos mecanicistas: (i) una falta de expresión de genes que codifican IFN tipo I y citocinas proinflamatorias en PBMC, lo cual fue consistente con la citometría de masas (Fig. 1C). ) y datos funcionales (Fig. 2); (ii) una onda temprana pero transitoria de expresión de ISG, que fue completamente consistente con el análisis de la secuencia de ARN de PBMC a granel (Fig. 4G y Fig. S15A) y se correlacionó fuertemente con un estallido temprano de IFN-α en plasma (Fig. 4F ), probablemente de origen pulmonar (17); y (iii) la expresión alterada de HLA-DR y CD86 pero la expresión mejorada de S100A12 en las células mieloides, lo cual fue consistente con los datos de citometría de masas (Fig. 5B), Olink (Fig. 3) y ELISA (Fig. S7) , y es un fenotipo que recuerda a las células supresoras derivadas de mieloides descritas anteriormente (25).

La infección grave por COVID-19 está asociada con la liberación sistémica de productos bacterianos.

El aumento de los niveles de mediadores proinflamatorios en el plasma, incluidos IL-6, TNF, TNFSF14, EN-RAGE y OSM (figura 3), se combinó con respuestas inmunitarias innatas suprimidas en los monocitos sanguíneos y las CD (figura 2 y figura S5). ) sugirió una condición clínica similar a la sepsis (26, 27). En este contexto, se ha sugerido previamente que las citocinas proinflamatorias y los productos bacterianos en el plasma pueden desempeñar funciones patógenas en la sepsis, y la combinación de estos factores podría ser importante para determinar la supervivencia del paciente (28, 29). Por lo tanto, para determinar si un mecanismo similar podría estar en juego en pacientes con COVID-19 grave, medimos el ADN bacteriano y el lipopolisacárido (LPS) en el plasma. En particular, el plasma de pacientes graves y de la UCI tenía niveles significativamente más altos de ADN bacteriano, medido por cuantificación de PCR de 16 bacterias.S ribosomal RNA (rRNA) gene product, and of LPS, as measured by a TLR4-based reporter assay (Fig. 6, A and B). Furthermore, there was a significant correlation between bacterial DNA or LPS and the plasma levels of the inflammatory mediators IL-6, TNF, MCP-3, EN-RAGE, TNFSF14, and OSM (Fig. 6C and fig. S19). These results suggest that the enhanced cytokine release may in part be caused by increased bacterial products in the lung or in other tissues.

Sistemas de evaluación biológica de la inmunidad a la infección por COVID-19 leve versus grave en humanos

Fig. 6 Systemic release of microbial products in severe COVID-19 infection.

(UNA y si) Box plots showing bacterial 16S rRNA gene (A) and LPS (B) measured in the plasma of healthy or infected individuals. qPCR, quantitative PCR. (C) Spearman’s correlation between cytokines and bacterial DNA measured in plasma. Each dot represents a sample (norte = 18 and 51 for healthy and infected, respectively). The colors of the dots indicate the severity of clinical disease, as shown in the legends. The boxes show median, upper, and lower quartiles in the box plots. The whiskers show 5th to 95th percentiles. The differences between the groups were measured by Mann-Whitney rank sum test; ***PAGS < 0.001; ****PAGS < 0.0001. NPX, normalized protein expression units; R, correlation coefficient.

Discussion

We used a systems biology approach to determine host immune responses to COVID-19. Mass cytometry analysis of peripheral blood leukocytes from two independent cohorts revealed several common features of immune responses induced upon SARS-CoV-2 infection. There was a notable and protracted increase in the frequencies of plasmablasts and effector CD8 T cells in the peripheral blood, consistent with recent studies (6, 8, 14). Notably, the effector T cells continued to increase up to day 40 after symptom onset. Studies have shown that SARS-CoV-2 infection induces exhaustion and apoptosis in T cells (30, 31). Whether the continuing effector CD8 T cell response reflects continuous exposure to antigen and whether the cells are exhausted will require further investigation.

In contrast to robust activation of B and T cells, we observed a significant decrease in the frequency of pDCs. Furthermore, mTOR signaling in pDCs was reduced significantly in COVID-19–infected individuals, as measured by decreased pS6 signaling by mass cytometry. These results suggest that pDCs, the primary producers of type I IFNs, are impaired in COVID-19 infection, which is consistent with studies in SARS-CoV infection (32). To determine whether the reduced mTOR signaling in pDCs resulted in impairment of type I IFN production, we stimulated cells in vitro with TLR ligands. Our results demonstrate that pDCs from COVID-19–infected patients are functionally impaired in their capacity to produce IFN-α in response to TLR stimulation. Taken together, these data suggest that COVID-19 causes an impaired type I IFN response in the periphery. Administration of type I IFN has been proposed as a strategy for COVID-19 intervention (33); however, it must be noted that type I IFN signaling has been shown to elevate angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) expression (34) in lung cells, which can potentially lead to enhanced infection.

In addition to the impaired IFN-α production by pDCs, there was a marked diminution of the proinflammatory cytokines IL-6, TNF-α, and IL-1β produced by monocytes and mDCs upon TLR stimulation (Fig. 2B). This was consistent with the lack of or diminished expression of the genes encoding IL-6 and TNF in the CITE-seq analysis (Fig. 5C). These results suggest an impaired innate response in blood leukocytes of patients with COVID-19. This concept was further supported by the CyTOF and flow cytometry data that showed decreased HLA-DR and CD86 expression, respectively, in myeloid cells (Fig. 5, D and E, and fig. S16). To obtain deeper insight into the mechanisms of host immunity to SARS-CoV-2, we performed CITE-seq single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq analysis in COVID-19 patients at various stages of clinical severity. Our data demonstrate that SARS-CoV-2 infection results in an early wave of IFN-α in the circulation that induces an ISG signature. Although the ISG signature shows a strong temporal dependence in our datasets, we also find that the ISG signature is strongly induced in patients with moderate COVID-19 infection (Fig. 4G). Consistent with this, Hadjadj et al. (5) have reported an enhanced expression of ISGs in patients with moderate disease compared with those with severe or critical disease. Taken together, these data suggest that SARS-CoV-2 infection induces an early, transient type I IFN production in the lungs that induces ISGs in the peripheral blood, primarily in patients with mild or moderate disease. Additionally, we observed reduced expression of genes encoding proinflammatory cytokines, as well as HLA-DR expression in myeloid cells, which was consistent with the CyTOF and flow cytometry data showing reduced HLA-DR and CD86 expression, respectively, in myeloid cells.

Our multiplex analysis of plasma cytokines revealed enhanced levels of several proinflammatory cytokines, as has been observed previously (35), and revealed a strong association of the inflammatory mediators EN-RAGE, TNFSF14, and OSM with the clinical severity of the disease. Notably, the expression of genes encoding both TNFSF14 and OSM were down-regulated in the PBMCs from COVID-19 patients with severe disease in the analysis of CITE-seq data (Fig. 5C), which suggests a tissue origin for these cytokines. The gene encoding EN-RAGE, however, was expressed at high levels in blood myeloid cells in patients with severe COVID-19 (Fig. 5, C to F) (although it is also possible that EN-RAGE is expressed in the lungs too). Of note, these three cytokines have been associated with lung inflammatory diseases. In particular, EN-RAGE has been shown to be expressed by CD14+ HLA-DRlo cells, the myeloid-derived suppressor cells, and it is a marker of inflammation in severe sepsis (21, 25, 36). Additionally, its receptor, RAGE, is highly expressed in type I alveolar cells in the lung (24). Notably, we observed that the classical monocytes and myeloid cells from severe COVID-19 patients in the single-cell RNA-seq data expressed high levels of S100A12, the gene encoding EN-RAGE, but not the typical inflammatory molecules IL-6 and TNF-α. These data suggest that the proinflammatory cytokines observed in plasma likely originate from the cells in lung tissue rather than from peripheral blood cells. Taken together with the mass cytometry data, the plasma cytokine data may be utilized to construct an immunological profile that discriminates between severe versus moderate COVID-19 disease (fig. S20).

These results suggest that SARS-CoV-2 infection results in a spatial dichotomy in the innate immune response, characterized by suppression of peripheral innate immunity in the face of proinflammatory responses that have been reported in the lungs (37). Furthermore, there is a temporal shift in the cytokine response from an early but transient type I IFN response to a proinflammatory response during the later and more severe stages, which is similar to that observed with other diseases such as influenza (38). Notably, there were enhanced levels of bacterial DNA and LPS in the plasma, which were positively correlated with the plasma levels of EN-RAGE, TNFSF14, OSM, and IL-6, which suggests a role for bacterial products—perhaps of lung origin—in augmenting the production of inflammatory cytokines in severe COVID-19. The biological consequence of the impaired innate response in peripheral blood is unknown but may reflect a homeostatic mechanism to prevent rampant systemic hyperactivation, in the face of tissue inflammation. Finally, these results highlight molecules such as EN-RAGE or TNFSF14, and their receptors, which could represent attractive therapeutic targets against COVID-19.

Acknowledgments: We thank all participants as well as the Hope Clinic and Emory Children Center staff and faculty. We particularly acknowledge K. Hellmeister, A. Kay, A. Cheng, J. Traenkner, A. M. Drobeniuc, H. Macenczak, N. McNair, Y. Saklawi, A. Mehta, M. Bower, T. Girmay, E. Butler, T. Sirajud-Deen, H. Huston, D. Kleinhenz, L. Hussaini, E. Scherer, B. Johnson, J. Kleinhenz, J. Morales, V.Karmali, Y. Xu, and D. Wang. We are grateful for the support of the Emory Department of Medicine and Pediatrics and the Georgia Research Alliance. We are thankful to the Human Immune Monitoring Center (HIMC) for assisting with sample shipments. We thank G. Kim and M. Blanco from the Stanford Functional Genomics Facility at Stanford University for assistance with single-cell RNA-seq and the Yerkes Nonhuman Primate (NHP) Genomics Core [supported in part by National Institutes of Health (NIH) grant P51 OD011132]. We thank the HIMC and the Parker Institute for Cancer Immunotherapy (PICI) for maintenance and access to the flow cytometer. We acknowledge the support of the clinicians who facilitated this study, including J. Y. H. Chan, D. P.-L. Lau, and Y. M. Ho, and the dedicated clinical team at the Infectious Diseases Centre, Princess Margaret Hospital, Hospital Authority of Hong Kong. We used equipment purchased with NIH grants (S10OD018220 and 1S10OD021763) to generate the data. Funding: This work was supported by NIH grants HIPC U19AI090023 (to B.P.), U19AI057266 (to B.P. and principal investigator R. Ahmed from Emory University), and U24AI120134 (to S.E.B.); the Sean Parker Cancer Institute; the Soffer endowment (to B.P.); the Violetta Horton endowment (to B.P.); a Calmette and Yersin scholarship from the Pasteur International Network Association (to H.L.); the National Natural Science Foundation of China (NSFC)–Research Grants Council (RGC) Joint Research Scheme (N_HKU737/18) (to C.K.P.M. and M.P.); the Guangzhou Medical University High-level University Innovation Team Training Program [Guangzhou Medical University released (2017) no. 159] (to C.K.P.M. and M.P.); the U.S. NIH (contract no. HHSN272201400006C) (to M.P.); and the RGC of the Hong Kong Special Administrative Region, China (project no. T11-712/19-N) (to M.P.). Next-generation sequencing services were provided by the Yerkes NHP Genomics Core, which is supported in part by NIH P51 OD 011132, and the data were acquired on a NovaSeq 6000 funded by NIH S10 OD 026799. Author contributions: Conceptualization: B.P., P.S.A., and F.W.; Investigation: P.S.A., F.W., C.K.P.M., M.P., N.S., Y.F., L.B., D.W., J.C., K.L.P., G.A., C.H., and M.P.M.; Data curation and analysis: P.S.A., F.W., M.S., T.H., N.S., Y.F., D.K., A.A.U., H.T.M., and B.P.; Patient recruitment and clinical data curation: C.K.P.M., M.P., L.B., O.T.-Y.T., G.A., W.S.L., J.M.C.C., T.S.H.C., C.Y.C.C., C.H., M.P.M., H.L., E.A., S.E., N.R., and M.P.; Supervision: B.P., M.P., N.R., P.K., H.T.M., S.E.B., and E.A.; Data visualization: P.S.A., F.W., M.S., and T.H.; Writing: P.S.A., F.W., M.S., T.H., and B.P.; Funding acquisition: B.P. All the authors read and accepted the manuscript. Competing interests: B.P. and P.S.A. are inventors on a provisional patent application (no. 63/026,577) submitted by the Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University, Stanford, CA, that covers the use of “Therapeutic Methods for Treating COVID-19 Infections.” Data and materials availability: The CITE-seq data and bulk transcriptomics data are publicly available in the Gene Expression Omnibus (GEO) under accession numbers GSE155673 and GSE152418, respectively. This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0) license, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. To view a copy of this license, visit https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. This license does not apply to figures/photos/artwork or other content included in the article that is credited to a third party; obtain authorization from the rights holder before using such material.

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