El nuevo enfoque de alto rendimiento produce bibliotecas de sondas para ensayos inmunológicos.

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IMAGEN: Este diagrama describe un flujo de trabajo para preparar y usar una biblioteca de multímeros de MHC cargados con péptidos para la evaluación de los repertorios de células T en muestras de sangre de pacientes.
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Crédito: Overall et al., Nature Communications, 2020

Una prueba inmunológica conocida como “ensayo de tetrámero” puede detectar y cuantificar las células T en una muestra de sangre que pueden reconocer un antígeno específico, como una proteína viral. Sin embargo, la fabricación de las sondas moleculares necesarias para este tipo de ensayo siempre ha sido un proceso difícil y lento.

Ahora, un equipo dirigido por investigadores de la UC Santa Cruz ha desarrollado un método para crear bibliotecas de sondas para evaluaciones de alto rendimiento a gran escala de repertorios de células T en muestras de sangre. El nuevo enfoque, descrito en un artículo publicado el 20 de abril en Comunicaciones de la naturaleza, abre nuevas oportunidades para la investigación inmunológica, el desarrollo de inmunoterapias contra el cáncer y la evaluación de las respuestas inmunitarias de pacientes con infecciones virales, incluido COVID-19.

“Toda persona en el campo sabe lo engorroso que es hacer las sondas para estos ensayos”, dijo el autor correspondiente Nikolaos Sgourakis, profesor asistente de química y bioquímica en la Universidad de California en Santa Cruz. “Con los métodos convencionales, se necesitaría aproximadamente una semana para hacer un solo complejo peptídico, pero ahora podemos hacer una placa de 100 en un día”.

Las células T juegan un papel central en el sistema inmune, complementario a los anticuerpos (producidos por las células B). Los anticuerpos reconocen y se unen a los antígenos (proteínas extrañas) en la sangre y otros fluidos corporales, mientras que las células T solo se unen a los antígenos que se muestran en las superficies de las células del cuerpo, lo que permite al sistema inmunitario detectar células infectadas o cancerosas.

Esta diferencia hace que las pruebas de anticuerpos sean relativamente sencillas y los ensayos de células T mucho más desafiantes. Para construir una sonda para detectar un receptor específico de células T, el antígeno correspondiente debe incorporarse en un complejo molecular que imite la forma en que se muestran los antígenos en las superficies celulares, unidos a las proteínas del complejo de histocompatibilidad (MHC). Sgourakis ha estado estudiando cómo se seleccionan los fragmentos de proteínas y se unen a las proteínas MHC en las células, y el nuevo método se basa en los descubrimientos de su laboratorio sobre el papel de las “chaperonas moleculares” en este proceso.

“Las chaperonas moleculares están diseñadas por la naturaleza para cargar proteínas MHC con péptidos en la célula, así que tomamos nuestra chaperona favorita y la reutilizamos”, dijo Sgourakis.

Su investigación previa había demostrado que la chaperona puede expulsar antígenos que tienen baja afinidad por la proteína MHC, asegurando que solo se una a los antígenos de alta afinidad que se pueden mostrar en la superficie celular en la conformación adecuada para activar una respuesta de células T. Entonces Sgourakis diseñó un péptido “marcador de posición” para usar en la preparación de grandes cantidades de complejos de MHC precargados. Cuando se incuba con un antígeno de alta afinidad, el marcador de posición se desplaza y esta reacción se puede realizar en paralelo con grandes cantidades de antígenos en un sistema de alto rendimiento.

“Es un multiplicador de fuerza, que nos permite realizar estas reacciones a un alto rendimiento”, dijo Sgourakis. “Muchos grupos están trabajando en metodologías similares, todas las cuales tienen sus pros y sus contras. Esta tecnología tiene la ventaja de usar el mismo sistema que las células usan de forma natural, y podemos combinarlo de manera muy elegante con las herramientas analíticas de una sola célula existentes. “

Este trabajo se realizó en estrecha colaboración con investigadores del Centro del Genoma de Nueva York y el Hospital de Niños de la Universidad de Pensilvania y la Escuela de Medicina Perelman. Los investigadores comenzaron a utilizar el nuevo método para desarrollar bibliotecas de sondas para evaluar las respuestas de las células T al neuroblastoma y diseñar inmunoterapias contra el cáncer.

Luego vino COVID-19, y el equipo comenzó a explorar formas de aplicar la nueva tecnología para abordar los desafíos del nuevo coronavirus. Con una infección viral, hay muchos fragmentos diferentes de las proteínas virales que puede mostrar una célula infectada, y es importante determinar cuál de estos péptidos provoca una fuerte respuesta inmune.

“Basado en el genoma del coronavirus, podemos predecir todos los péptidos posibles, sintetizarlos, cargarlos en tetrámeros de MHC y realizar una expedición de pesca para encontrar cuáles son reconocidos por las células T en las muestras de sangre de los pacientes”, explicó Sgourakis. “Ciertos péptidos son inmunodominantes, dirigen la respuesta inmune, y esos son los que queremos descubrir para que podamos usarlos potencialmente en una vacuna”.

Este enfoque también se puede utilizar para comparar los repertorios de receptores de células T en diferentes cohortes de pacientes. A medida que las personas envejecen, su repertorio de células T disminuye, lo que da como resultado una capacidad disminuida para montar una respuesta inmune a una nueva amenaza. Esta puede ser la razón por la cual las personas mayores son más vulnerables a COVID-19.

“Una de las grandes preguntas es por qué hay tanta variabilidad en la gravedad de esta enfermedad”, dijo Sgourakis. “Podemos usar esta tecnología para evaluar a los pacientes y ver cuáles son las brechas en sus repertorios de células T, y tal vez usar esto como un diagnóstico para el cual los pacientes necesitarán un tratamiento más intensivo”.

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Los coautores del artículo incluyen a los coprimeros autores Sarah Overall y Jugmohit Toor en UC Santa Cruz; Stephanie Hao y Peter Smibert en el Centro del Genoma de Nueva York; Mark Yarmarkovich, Son Nguyen, Alberto Japp, Michael Betts y John Maris en la Universidad de Pennsylvania; y Sara O’Rourke, Giora Morozov, Nicolás González y Danai Moschidi en la UC Santa Cruz. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud.

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